一文讀懂自身抗體檢測技術！

自身免疫性疾?。╝utoimmune disease, AID）是由于免疫系統(tǒng)對自身抗原失去免疫耐受，進一步誘發(fā)組織損傷和炎癥反應并最終導致靶器官受損的一類慢性疾病。目前已知的AID有100多種，累及多器官、多系統(tǒng)。AID總體發(fā)病率占世界人口的5%，被世界衛(wèi)生組織列為繼心腦血管疾病、癌癥后威脅人類健康的第三大殺手。中國保守估計有5000萬人患有AID，自身抗體檢測對AID的預測、診斷和治療至關重要。

一、自免疾病診斷市場規(guī)模

近幾年，伴隨AID發(fā)病率日益升高的同時，AID疾病的早診率也在逐年提升，這主要得益于自身抗體檢測技術的發(fā)展和普及。近二十年來，作為自身抗體檢測的經典方法學，間接免疫熒光法（IIFT）、免疫印跡法（IBT）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）已經成為自身免疫性疾病實驗室診斷的主流方法，適用于不同層級的醫(yī)院，其檢測效能在長期的臨床實踐獲得了驗證和認可，被國內外相關指南和專家共識所推薦。

與此同時，我國自身抗體檢測的市場規(guī)模也在不斷提高，據新冠疫情前數據推測，預計2023年我國自身抗體檢測市場規(guī)模在22.3億元左右，2018~2023年復合增長率在14%左右。

我國自身抗體檢測市場規(guī)模增長情況（億元）

圖片資料來源：安信證券研究中心、立鼎產業(yè)研究調研

二、自身抗體檢測方法淺析

對于自身抗體的檢測，特別是常規(guī)檢測項目—抗核抗體（ANA）的檢測，IIFT一直都是檢測方法的“金標準”。而對于特異性自身抗體檢測，目前市場上不斷有新的方法學出現(xiàn)，從經典的免疫印跡法、ELISA、到化學發(fā)光法（CLIA）、流式熒光法和磁條碼免疫熒光法。針對如此多樣的方法學，本文將進行系統(tǒng)的介紹，為臨床實驗室進行正確選擇提供參考。

1、間接免疫熒光

間接免疫熒光技術（IIFT）因其獨具的技術優(yōu)勢成為自身抗體檢測的“金標準”，是國內外公認的自身抗體篩查首選方法。

首先，該方法以細胞或組織為檢測基質，保留了抗原譜的完整性，保證了自身抗體篩查的敏感性。如HEp-2細胞包含了多達100種靶抗原，可以做到對抗核抗體的全面篩查。同時，以抗原轉染細胞為基質的IIFT亦是一種特異性抗體確認方法。 該技術將細胞中含量較低的靶抗原以其天然構象大量表達在細胞表面，極大提高了特異性抗體檢測的靈敏度和特異性。

隨著IIFT技術的廣泛應用，臨床實驗室對自動化要求日益迫切，目前市場上已經推出了從加樣到判讀的全自動化檢測平臺，大大提升了實驗室的工作效率并提高了檢測結果判讀的標準化。

2、免疫印跡法

免疫印跡法作為多指標聯(lián)檢的特異性抗體確認技術，自90年代初進入中國以來，現(xiàn)已普遍應用于自身抗體檢測。該技術是將各種特異性抗原呈條帶狀包被于理化性質相匹配的不同材質的膜基質上，各種抗原包被帶之間間隔一定的距離，由此保證了檢測結果的高靈敏高特異性，并完全避免各種抗原間的結果干擾。

根據2022年國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心（NCCL）室間質評上報的1752家實驗室數據統(tǒng)計，ENA靶抗原檢測的方法學中，使用免疫印跡法的實驗室占比80%，是目前自免領域份額占比最大的方法學，且質評結果準確率達到98%，可以看出免疫印跡法使用率很高，備受臨床實驗室的認可，是自身抗體檢測的主流方法學。 

免疫印跡法備受青睞，究其原因主要是該技術操作簡單、性能優(yōu)異，多指標聯(lián)檢完全符合臨床特異性抗體篩查和確認的需求，經濟又高效。此外，免疫印跡法提供的是具有臨床意義的半定量檢測結果，這種半定量等級結果和抗體水平呈線性相關，且這種相關性已經過長期的臨床驗證，為臨床診斷的把握度和病情的嚴重程度判斷提供了依據。

因此，免疫印跡法憑借自身的諸多優(yōu)勢，穩(wěn)居自身抗體靶抗原確認檢測方法中的主導地位。

3、化學發(fā)光法

化學發(fā)光法（CLIA）是一種將高特異性的免疫反應和高靈敏度的化學發(fā)光測定技術相結合的檢測技術。該技術根據化學反應產生的輻射光強度來確定物質含量，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測。CLIA具有反應速度快、檢測靈敏度高、線性范圍寬、精密度高，可隨到隨檢等優(yōu)勢。

其中，吖啶酯直接化學發(fā)光是目前比較公認的高性能檢測技術，具有標記物穩(wěn)定、信號強、背景低、干擾因素少、靈敏度高等諸多優(yōu)勢。如吖啶酯對被標記的抗原、抗體活性無影響，完整保留了抗原抗體的表位活性；吖啶酯光釋放快速集中，且發(fā)光效率和發(fā)光強度均較大；更重要的是，該反應體系無需催化劑和增強劑，只要在H2O2和OH-存在下就能迅速產生化學發(fā)光，可以極大的降低背景發(fā)光值，提高信噪比。

CLIA近幾年被廣泛應用于自身抗體檢測領域，根據國家風濕病數據中心（CRDC）室間質評數據統(tǒng)計，從2015年到2020年的5年間，使用CLIA檢測的實驗室不但從無到有，且數量占比大幅上升，如dsDNA和MPO/PR3抗體檢測，2020年采用CLIA的實驗室占比分別達到14.7%和 22.4%?？梢奀LIA在自身抗體檢測領域占有率越來越高。

相關研究和指南均指出ANA、ANCA中多種特異性抗體的水平與疾病嚴重程度、活動度、預后等相關，對隨訪監(jiān)測有指導意義。如，dsDNA抗體、核小體的抗體水平與疾病活動度相關[1]，MPO抗體滴度與腎小球新月體形成數目及疾病活動度相關等[2]。2020年《自身免疫病抗體檢測方法的推薦意見》也推薦CLIA用于多種自身抗體的檢測[3]。因此CLIA對自身抗體的定量檢測結果能為臨床提供更多的參考，符合自身抗體檢測的臨床需求和發(fā)展趨勢。同時，因CLIA為單指標檢測，可根據疾病臨床診斷路徑對相應的指標進行單獨或組合檢測，不必每次進行全套自身抗體譜檢測，因此，可以降低醫(yī)保及患者負擔，符合DRG/DIP政策的實施。

對于化學發(fā)光在自身抗體檢測方面的應用，已經有很多研究。如對于系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的ANA檢測[4]，CLIA的檢測靈敏度、特異性、陰陽性預測值都高于流式熒光（見表一），且CLIA與金標準IIFT的陽性和陰性符合率均高于流式熒光法，CLIA與免疫印跡法的陽性和陰性符合率也均高于流式熒光法（見表二）。

表一：ANA檢測方法對SLE的診斷價值圖片

表二：不同方法學檢測ANA的一致性分析

注：IIFA（間接免疫熒光法）、CMIA（化學發(fā)光法）、MBI（流式熒光法）、LIA（免疫印跡法）

因此，CLIA作為單指標定量檢測，具有快速、高靈敏、線性范圍寬等諸多技術優(yōu)勢，能真正滿足臨床對檢測結果的定量需求，會成為未來檢測自身抗體的趨勢。

4、流式熒光法

流式熒光法是基于熒光編碼微球和流式技術，主要應用于蛋白和核酸檢測領域，近幾年被用于自身抗體檢測領域，和免疫印跡法一樣同屬于多指標聯(lián)檢技術。該技術是以不同熒光編碼微球標記各類靶抗原的液相反應體系，免疫反應后，通過流式檢測儀測定各類靶抗原對應的二抗熒光強度，以此來檢測樣本中的自身抗體。對于抗核抗體多指標篩查，除dsDNA和C1q為定量外，其他14項指標均不能進行定量檢測。因此，雖然流式熒光檢測可提供數值化結果，但這些指標的數值結果并不能準確代表樣本中抗體水平的高低。

流式熒光技術具有全自動化、多指標聯(lián)檢、隨機進樣等優(yōu)勢，但該技術在自身抗體檢測領域的應用時間較短，產品性能未被臨床長期驗證，并且檢測技術還有待改進之處。如，該技術受嗜異性抗體干擾比較突出，Kricka等報道[5]超過80%的人血清中含有異嗜性抗體，至少一半人的血清可以產生這種非特異性結合。Waterboer T團隊發(fā)現(xiàn)[6]，在流式熒光檢測中，至少59%的非洲人血清中的嗜異性抗體可以和微球產生非特異性結合，導致檢測的背景信號過高干擾檢測結果。雖然可以通過優(yōu)化微球處理技術來抑制這種非特異性結合，但同時也會抑制特異性結合。其次，流式熒光的檢測結果易受溫度影響，從而降低了檢測結果的準確性。有研究對涵蓋高、中、低濃度的臨床樣本進行分析，與定標溫度25℃偏差±5℃時，測值出現(xiàn)顯著的負偏倚，從而導致陽性樣本可能出現(xiàn)陰性結果，高滴度樣本出現(xiàn)低滴度結果[7]；此外，流式檢測中用到的鞘液對溫度要求高，為保證液流斷點的穩(wěn)定性，室溫需要控制在25°C±1°C，如果溫度升高或降低都會影響檢測性能；同時鞘液容易造成儀器玻璃管堵塞，導致玻璃管損耗率高，增加用戶檢測成本。所以，在流式熒光的日常檢測中，實驗室必須注意嚴格控制儀器和環(huán)境的溫度。

因此，流式熒光法在檢測自身抗體方面，還需要走一段較長的道路，彌補在穩(wěn)定性、檢測結果參考價值等方面的不足，特別是需要較長時間的臨床驗證。

5、磁條碼免疫熒光

磁條碼免疫熒光技術近兩年開始用于自身抗體檢測領域，也是一種液相多指標聯(lián)檢方法。該技術特點主要為通過各種光刻標記的芯片偶聯(lián)不同抗原，免疫反應結束后，通過明場拍照識別各類靶抗原位置、暗場拍照測定各類靶抗原對應的二抗熒光強度，以此來檢測樣本中所含的自身抗體。同樣，對于抗核抗體篩查，除抗dsDNA抗體為定量檢測，其他14個指標均為定性檢測。因此，也需要注意，這些定性指標的檢測結果雖有數值表示，但和抗體水平并無顯著相關性。

磁條碼免疫熒光檢測技術具有全自動化、隨機進樣等優(yōu)勢，但在自身抗體檢測領域起步較晚，技術還不夠成熟。首先，在反應信號檢測時，同一反應孔中各芯片之間的熒光信號有可能互相干擾，從而影響檢測結果的準確性。例如，在拍照讀取結果時，芯片之間容易重疊，強熒光對弱熒光產生影響；拍照不能有效采集到芯片反面的熒光。其次，芯片的尺寸過大，在反應體系中不能穩(wěn)定分散，導致抗原抗體的不能充分結合。

因此，在自身抗體檢測方面，磁條碼熒光技術屬于剛起步，還需進行持續(xù)的技術完善，并經過長期的臨床驗證后，才能真正成為符合臨床檢測要求的方法學。

三、各方法學特點匯總

綜合臨床實踐以及實際操作中的表現(xiàn)，將各方法學匯總比對如下表：

1.在定量方面, 化學發(fā)光法能進行定量檢測，可滿足臨床精準檢測需求；免疫印跡法可提供灰度數值和結果等級的半定量結果，等級結果和抗體水平顯著相關；流式熒光法和磁條碼免疫熒光法以定性/半定量檢測為主，其數值結果和抗體水平無顯著相關性。因此，對于非定量檢測的指標過度強調其數值結果將誤導臨床對病情嚴重程度的判斷。

2.在檢測項目選擇方面，免疫印跡法、流式熒光法及磁條碼免疫熒光法均為多指標聯(lián)檢的方法，適于抗體譜篩查?；瘜W發(fā)光法檢測為單指標檢測， 抗體項目可以按需靈活選擇，在通量較大的檢測平臺上亦可進行抗體譜篩查。

3.在檢測通量方面，免疫印跡法和流式熒光法及磁條碼免疫熒光法的整體水平相當。因后兩者的技術尚不穩(wěn)定，實驗室需先得到質控品檢測的結果，才開始檢測樣本，所以在整體檢測通量上三者相當。

4.在檢測性能方面：免疫印跡法和化學發(fā)光法無指標間的相互干擾，并且其非特異性干擾也遠低于流式熒光法和磁條碼免疫熒光法，技術成熟度相對較高，檢測結果較為穩(wěn)定可靠。

上述各方法學的性能差異也體現(xiàn)在室間質評的結果上。如2021-2022 NCCL質評驗證結果顯示，磁條碼免疫熒光法和流式熒光法檢測的質評通過率較低，特別是對于RNP和Sm指標的質評結果， 這兩種方法的假陰性率高達35%和72%；而使用免疫印跡試劑檢測的實驗室數量多達800+家，質評通過率高；化學發(fā)光試劑用戶不多但質評通過率很高。

四、總結

綜上所述，免疫印跡法經歷了長期的用戶驗證，性能已經被廣泛認可，在今后很長時間內依舊是臨床主要的檢測方法。

流式熒光法和磁條碼免疫熒光法是近幾年開始應用于自身抗體檢測領域，起步較晚，在臨床應用中的優(yōu)勢尚不明顯。兩者以定性檢測為主，稍遜于免疫印跡法的半定量。由于其發(fā)展時間尚短，技術還在逐步發(fā)展和完善過程中，所以在檢測性能、用戶認可度等方面也有待提升。

在自身抗體檢測領域，化學發(fā)光法是全定量檢測的代表方法學。由于其是單指標檢測，可靈活組合，符合DRG/DIP的醫(yī)保政策和臨床精準檢測需求，是今后定量檢測需求的不二選擇。

隨著時代的發(fā)展，醫(yī)學技術的不斷創(chuàng)新與進步，未來將會有越來越多的方法學應用于自身抗體檢測領域，可謂百家爭鳴。各種方法學有其各自的優(yōu)勢與短板，正可謂一枝獨秀不是春，百花齊放春滿園。自身抗體檢測技術的蓬勃發(fā)展，為用戶帶來了更多的選擇空間，滿足了更多的應用場景。用戶只需從使用的需求出發(fā)，對方法學進行全面的評估，就能找到最適合自己實驗室的檢測技術。

參考文獻：

1.Shang XY et al. Anti-dsDNA, anti-nucleosome, anti-C1q, and anti-histone antibodies as markers of active lupus nephritis and systemic lupus erythematosus disease activity, Immun Inflamm Dis. 2021;1–12.

2.呂遠帆，帥宗文.抗髓過氧化酶物自身抗體對MPO-ANCA相關性血管炎臨床表現(xiàn)的影響[J].安徽醫(yī)學.2014,35(2)：259-261.

3.免疫學會臨床免疫分會專家組.自身免疫病抗體檢測方法的推薦意見[J].中華檢驗醫(yī)學雜志.2020,43(9)：878-888.

4.Kricka LJ. Human Anti-Animal Antibody Interferences in Immunological Assays. Clin Chem,1999, 45(7):942-56.

5.Wei QJ et al. Comparison of chemiluminescence microparticle immunoassay, indirect immunofluorescence assay, linear immunoassay and multiple microbead immunoassay detecting autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Scand J Immunol. 2020, 91(3): e12849.

6. Waterboer T et al. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. Journal of Immunological Methods, 2006, 309 (1-2): 200–204.

7.賀雯,鄒雅如,魯瓊等.環(huán)境溫度對Luminex流式熒光免疫分析法測定糖類抗原242結果的影響[J].第二軍醫(yī)大學學報,2019,(第7期)