一文讀懂，PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR和Real-Time PCR之間的區(qū)別

在平常學(xué)習(xí)和生活過(guò)程中，我們常會(huì)遇到各種PCR叫法，包括PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR，很多人往往難以弄清楚這幾種PCR有什么區(qū)別。下面簡(jiǎn)單的介紹一下這幾種PCR之間的區(qū)別。

一、PCR是什么？

PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）的簡(jiǎn)稱(chēng)，是美國(guó)科學(xué)家Kary B. Mullis1985年發(fā)明的一種在體外快速擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。Mullis 因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，在生物科學(xué)領(lǐng)域、分子診斷領(lǐng)域、親子鑒定、法醫(yī)鑒定以及犯罪調(diào)查等方面發(fā)揮了巨大作用，是迄今為止最為重要的技術(shù)之一。經(jīng)過(guò)演化和革新，PCR技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了三代：普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）以及數(shù)字PCR（dPCR）。

圖1 PCR儀器的發(fā)展歷程

二、PCR的原理及步驟

PCR的基本原理與DNA在體內(nèi)復(fù)制相似，特異性主要依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性、退火和延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

①模板DNA的變性：DNA模板經(jīng)過(guò)高溫（95℃左右）加熱一段時(shí)間后，解離成單鏈，以便能夠與引物結(jié)合；

②DNA模板與引物的退火（復(fù)性）：將溫度降至55℃左右時(shí)，引物與模板DNA單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則互相結(jié)合；

③引物的延伸：再將溫度調(diào)至72℃左右（DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度），DNA模板和引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，沿著5'→3'的方向合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸重復(fù)若干個(gè)循環(huán)后，就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

圖2 PCR的基本原理

圖3 PCR的流程步驟

三、PCR的分類(lèi)

1.普通 PCR

普通PCR即第一代PCR，普通PCR擴(kuò)增儀即可擴(kuò)增靶基因，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR，即Real-Time PCR，即第二代PCR，是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光染料或者熒光基團(tuán)，在整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)收集熒光信號(hào)來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每一個(gè)循環(huán)中擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最后通過(guò)CT值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)檢測(cè)樣品進(jìn)行定量分析。qPCR在聚合酶鏈反應(yīng)“變性一退火一延伸”擴(kuò)增過(guò)程的“延伸”段，對(duì)熒光探針標(biāo)記的靶基因熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)采集，通過(guò)3個(gè)參數(shù)(熒光信號(hào)-Ct值-靶基因的起始濃度)間的關(guān)系，最終確定靶基因的拷貝數(shù)或基因的表達(dá)水平。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 極大地?cái)U(kuò)展了PCR 技術(shù)在整個(gè)生命科學(xué)的研究與應(yīng)用，例如，感染性疾病、腫瘤遺傳性疾病、移植配型、個(gè)性化用藥等眾多醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。尤其是在臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域迅速發(fā)展，成為許多病原微生物診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于定量 PCR 的絕對(duì)定量分析結(jié)果最終依賴(lài)于 Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，這是其最大的技術(shù)瓶頸，所以在某種意義上所謂的“定量”也只是相對(duì)的。而且在低拷貝靶基因分子模板濃度差異細(xì)微的條件下其檢測(cè)靈敏度、精確度和分辨率都受到了限制。

qPCR常用的熒光主要有兩種：TaqMan探針?lè)ê蚐YBR Green法。

①熒光探針?lè)ǎ═aqMan技術(shù)）：

TaqMan探針是最早用于定量的方法，也是臨床檢測(cè)中最常用的檢測(cè)方法。Taqman探針是最為常用的一種水解探針，在探針的5’端存在一個(gè)熒光基團(tuán)，通常為FAM，探針本身則為一段與目的基因互補(bǔ)的序列，在探針的3’端有一個(gè)熒光猝滅基團(tuán)，根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理(F?rster resonance energy transfer， FRET)，當(dāng)報(bào)告熒光基團(tuán)（供體熒光分子）和猝滅熒光基團(tuán)（受體熒光分子）激發(fā)光譜重疊且距離很近時(shí)（7-10nm），供體分子的激發(fā)可以誘發(fā)受體分子發(fā)熒光，而自身熒光減弱。所以PCR反應(yīng)開(kāi)始，探針游離于體系中完整存在時(shí)，報(bào)告熒光基團(tuán)并不會(huì)發(fā)出熒光，當(dāng)退火時(shí)，引物和探針結(jié)合于模板，在延伸階段，聚合酶不斷的合成新鏈，由于DNA聚合酶具有5’-3’核酸外切酶活性，到達(dá)探針時(shí)，DNA聚合酶就會(huì)將探針從模板上水解下來(lái)，報(bào)告熒光基團(tuán)和猝滅熒光基團(tuán)分開(kāi)，釋放熒光信號(hào)。由于探針和模板存在一對(duì)一的關(guān)系，所以在試驗(yàn)的精度和靈敏度上，探針?lè)ǘ家獌?yōu)于染料法。每擴(kuò)增一條DNA，就形成一個(gè)熒光分子，PCR產(chǎn)物的形成與熒光分子的形成完全同步，PCR產(chǎn)物越多，熒光信號(hào)累積的越多，熒光強(qiáng)度越大。

優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)特異性強(qiáng)；靈敏度高；適合進(jìn)行多重qPCR檢測(cè)；PCR后續(xù)無(wú)需處理，節(jié)省時(shí)間和原料成本。

缺點(diǎn)：需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針；探針的水解依賴(lài)Taq酶外切酶的活性，定量時(shí)容易受試劑和酶性能影響；淬滅難以徹底，本底較高；檢測(cè)結(jié)果很難判斷實(shí)際的擴(kuò)增特性。

②熒光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是熒光定量PCR中最常用的熒光染料，它能夠與所有的雙鏈DNA結(jié)合。在PCR反應(yīng)體系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就會(huì)在過(guò)程中與雙鏈DNA結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此，反應(yīng)中發(fā)出的全部熒光信號(hào)就會(huì)與反應(yīng)中雙鏈DNA的量呈正比，熒光強(qiáng)度也會(huì)隨著產(chǎn)物的增加而增加。但是由于染料與雙鏈DNA是非特異性結(jié)合，因此可能產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。

優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格相對(duì)較低；使用方便；對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇，通用性好；檢測(cè)靈敏度高。

缺點(diǎn)：可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，需要通過(guò)熔解曲線分析識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性；需要不斷優(yōu)化反應(yīng)體系以降低非特異性擴(kuò)增；不適合進(jìn)行多重qPCR檢測(cè)。

圖4 熒光探針?lè)ê蜔晒馊玖戏ǖ墓ぷ髟?/p>

注：多重PCR，也稱(chēng)多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù)。

3.數(shù)字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）

數(shù)字PCR即第三代PCR，即絕對(duì)定量PCR。與傳統(tǒng)技術(shù)不同，基于泊松分布原理，數(shù)字 PCR 技術(shù)將 DNA 或RNA 樣品分散成大量的微反應(yīng)單元（納升級(jí)）中，然后對(duì)眾多微反應(yīng)單元內(nèi)的靶序列進(jìn)行單分子模板 PCR 擴(kuò)增、熒光檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，不依賴(lài)于標(biāo)準(zhǔn)曲線和已知濃度的多個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)品，直接檢測(cè)樣品中核酸的原始濃度。由于這種檢測(cè)方式具有比傳統(tǒng)熒光定量 PCR 更加出色的靈敏度和精確性，數(shù)字 PCR 迅速得到廣泛的關(guān)注，尤其在痕量核酸樣本檢測(cè)、復(fù)雜背景下稀有突變檢測(cè)、核酸拷貝數(shù)變異和基因表達(dá)量微小差異鑒定方面表現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)已被普遍認(rèn)可。

圖5 數(shù)字PCR的基本原理

4. 逆轉(zhuǎn)錄PCR（ Reverse T ranion - PCR , RT - PCR）

逆轉(zhuǎn)錄PCR或者稱(chēng)反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse tranion-PCR, RT-PCR），是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）稱(chēng)作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴(lài)RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來(lái)完成。隨后，DNA的另一條鏈通過(guò)脫氧核苷酸引物和依賴(lài)DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無(wú)論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無(wú)RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR技術(shù)靈敏且應(yīng)用廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通過(guò)一步法或兩步法進(jìn)行，一步法是RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)在同一試管中進(jìn)行；而在兩步法中兩個(gè)反應(yīng)是分開(kāi)依次進(jìn)行的。

5.實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-time RT-PCR, RT-qPCR）

Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的組合，其中的“RT”是Reverse tranion（逆轉(zhuǎn)錄）的意思，所以RT-qPCR是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的逆轉(zhuǎn)錄PCR，即以mRNA或總RNA為模板，先反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板，通過(guò)熒光定量PCR進(jìn)行定量檢測(cè)分析。因?yàn)镽T-PCR只可以定性，但不能進(jìn)行定量分析。與RT-PCR一樣，RT-qPCR定量分析RNA也有兩種方法：一步法和兩步法。兩種方法都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再將其作為qPCR擴(kuò)增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一試管中進(jìn)行，兩步法中的RT和qPCR是按順序分開(kāi)進(jìn)行。