環(huán)境采樣微生物樣本的幾種保存方法

微生物樣本保存是指保持微生物菌株活力和遺傳特征的技術(shù)。微生物在使用和傳代過(guò)程中很容易受到污染、變異甚至死亡，往往會(huì)導(dǎo)致菌株退化。菌種保存的目的是保持菌種的活力，避免損失，防止外來(lái)微生物的污染，盡量減少或防止變異，保持菌種原有的活力和特性。菌種保存的基本原理是使微生物的生命活動(dòng)進(jìn)入半永久休眠狀態(tài)，換句話說(shuō)，就是將微生物的新陳代謝限制在最低范圍內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)室常用的保存方法包括甘油保存法、斜面保存法、穿刺保存法、液體石蠟覆蓋法、沙漠土壤保存法和冷凍干燥法。在這些保存方法的基礎(chǔ)上，微生物有機(jī)體開(kāi)發(fā)了一種陶瓷珠保存法，能更有效地保存菌株。

1. 甘油保存法

這種方法適用于菌種的中長(zhǎng)期保存，可保存 1 年以上。由于甘油本身很濃稠，難以計(jì)量，通常以 1:1 的比例與生理鹽水混合，配制成最終濃度為 50%的甘油溶液。使用時(shí)，應(yīng)按 50%甘油：1:1 菌液的比例與菌液混合，使甘油的最終濃度為 20%-30%，甘油濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于菌種保存。將甘油菌種移至-80℃冰箱中長(zhǎng)期冷凍。需要使用菌種時(shí)，將冷凍管放入 37°C 水浴中快速解凍，直至菌種完全融化，即可取出菌種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

這種方法適用范圍廣，操作簡(jiǎn)單，保存期長(zhǎng)，菌種不易發(fā)生變異。

2. 斜面保存法

將菌種接種到合適的固體斜面培養(yǎng)基中。細(xì)菌充分生長(zhǎng)后，將其轉(zhuǎn)移到 4°C 的冰箱中保存。保存時(shí)間取決于微生物的類(lèi)型。一般來(lái)說(shuō)，霉菌、放線菌和孢子形成菌需要每 2-4 個(gè)月傳代一次，酵母菌每?jī)蓚€(gè)月傳代一次，細(xì)菌最好每月傳代一次。需要使用菌種時(shí)，可以用接種環(huán)從斜面上取少量細(xì)菌進(jìn)行接種。

這種方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，使用方便，不需要特殊設(shè)備，可以隨時(shí)檢查保存的菌種是否死亡、變異或被外來(lái)菌污染。缺點(diǎn)是保存期短，菌種易發(fā)生變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的理化性質(zhì)不是嚴(yán)格恒定的，反復(fù)通過(guò)會(huì)改變微生物的新陳代謝，而且這種方法被外來(lái)菌污染的幾率較高。

3. 刺穿保存法

準(zhǔn)備一管半固體運(yùn)送培養(yǎng)基，用接種針挑取菌種，從半固體培養(yǎng)基中心垂直刺入，直至接近試管底部，但不要刺穿，然后沿原穿刺線拔出接種針，放入 4℃冰箱保存。此法與斜面保存法一樣，需要定期傳代。

4. 液體石蠟覆蓋保存法

這種方法是斜面保存法的輔助方法。將菌株接種到合適的固體斜面培養(yǎng)基中。細(xì)菌充分生長(zhǎng)后，注入無(wú)菌液體石蠟覆蓋整個(gè)斜面，然后直立保存在 4 ℃ 冰箱中。液體石蠟可以防止培養(yǎng)基中水分蒸發(fā)導(dǎo)致菌株死亡，還可以使菌株與空氣隔離，降低菌株的代謝活性，延長(zhǎng)保存時(shí)間。需要使用菌種時(shí)，可以用接種環(huán)從斜面上挑取少量菌種。

這種方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，不需要特殊設(shè)備，不需要經(jīng)常傳代，保存時(shí)間較長(zhǎng)。缺點(diǎn)是儲(chǔ)存時(shí)必須直立放置，占用空間較大。

5. 沙漠土壤保存法

將培養(yǎng)好的菌種與無(wú)菌的沙漠土壤混合，將細(xì)菌吸附在沙漠土壤載體上。干燥后轉(zhuǎn)入 4°C 冰箱保存。使用菌種時(shí)，取出幾粒沙子即可。

這種方法操作簡(jiǎn)單，菌種保存時(shí)間長(zhǎng)。

6. 冷凍干燥法

將菌種冷凍，通過(guò)加壓升華去除水分。這樣可以減少細(xì)胞的生理活動(dòng)，長(zhǎng)期保持菌種的存活狀態(tài)。需要使用菌種時(shí)，使用無(wú)菌水或培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)。

這種方法適合菌體的長(zhǎng)期保存，但相關(guān)設(shè)備和操作較其他保存方法復(fù)雜。

7. 陶瓷珠保存法

在上述幾種保存方法的基礎(chǔ)上，微生物開(kāi)發(fā)了陶瓷珠保存法。與傳統(tǒng)的保存方法相比，這種方法具有更好的保存效果，既方便又能減少反復(fù)凍融造成的損傷。

每個(gè)陶瓷珠冷凍管包含 12 個(gè)磨砂陶瓷珠和菌種保存液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌株移入冷凍管中，將其翻轉(zhuǎn)混合，此時(shí)菌株會(huì)均勻分布在保存液中。用移液管移去保存液，在表面張力的作用下，每個(gè)瓷珠上都會(huì)覆蓋一層保存液，菌株就保存在這層保存液中。裝有菌種的冷凍管可轉(zhuǎn)移到 -80°C 進(jìn)行長(zhǎng)期冷凍（一般可保存 1 年左右）。

需要使用菌種時(shí)，將冷凍管從-80℃冰箱中取出，輕輕搖動(dòng)使陶珠分散，取一顆陶珠接種到培養(yǎng)基平板上進(jìn)行條培養(yǎng)，或接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)。接種后，迅速將冷凍管放回冰箱。

對(duì)于厭氧菌株，我們還可以提供含有還原劑的厭氧保存液，并對(duì)菌株進(jìn)行真空包裝，以避免菌株因接觸氧氣而死亡。

菌種保存的方法很多，但原理大同小異。

首先要選擇優(yōu)良純種。使用微生物的孢子、芽孢和無(wú)性體；

其次，創(chuàng)造低溫、干燥、缺氧等條件，抑制微生物的代謝功能，使其生命活動(dòng)降到最低水平或進(jìn)入休眠狀態(tài)，從而延長(zhǎng)菌種的壽命，保存菌種的原形，防止變異。無(wú)論采用哪種保存方法，都要求菌種在保存過(guò)程中不死亡、不被外來(lái)細(xì)菌污染、不降解。

短期保存 斜面保存

斜面保存是目前最常用的短期保存方法，操作簡(jiǎn)單，使用方便，但需要定期接種。因此工作量大，通過(guò)次數(shù)多易發(fā)生變異。因此，只適用于經(jīng)常使用的短期菌種。

1. 配制培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度應(yīng)稍低，尤其是糖類(lèi)盡量多一些，如果菌種產(chǎn)酸，則應(yīng)加入少量碳酸鈣；

2. 斜面填充量，斜面以?xún)A斜后不超過(guò)試管長(zhǎng)度的 1/2 為宜；

3. 斜面培養(yǎng)，溫度略低于最適溫度，時(shí)間略長(zhǎng)；

4. 生長(zhǎng)完成后，密封保存于 2-8℃冰箱中。每個(gè)通道，霉菌、放線菌、孢子形成菌可保存 1-3 個(gè)月，酵母菌可保存 2 個(gè)月，細(xì)菌可保存 1 個(gè)月。

激活和使用：

從冰箱中取出斜面，挑取菌落繁殖細(xì)菌，或剪取霉菌繁殖培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后即可使用。

長(zhǎng)期保存： 冷凍儲(chǔ)存

冷凍保存是目前最常用的長(zhǎng)期保存方法之一，適用于各類(lèi)微生物。與斜面貯藏相比，它減少了工作量，延長(zhǎng)了貯藏時(shí)間。

1. 準(zhǔn)備新鮮的斜面或平板培養(yǎng)物、10% 無(wú)菌甘油溶液；

2. 2. 用甘油溶液洗去細(xì)菌或孢子，形成細(xì)菌懸浮液；

3. 3. 將菌懸液分裝，每管 1 毫升，裝入冷凍管中，然后放入程序冷卻箱中；

4. 4. 將程序冷卻盒放入-80℃冰箱中冷凍；

5. 可保存 1-2 年。

激活和使用：

1. 從冷凍箱中取出冷凍菌種，準(zhǔn)備在水浴中溶解，不要在室溫下融化；

2. 將菌種迅速放入水浴中快速溶解，細(xì)菌 40℃，真菌 30℃，約 2 分鐘后全部溶解，然后接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基中；

3. 在適當(dāng)條件下完成培養(yǎng)。

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